随着医学的发展，人类发现了越来越多的疑难病例，各种病原体的变异导致了复杂感染性疾病发生率逐渐增加，精准快速的病原学诊断可以帮助临床医师及时优化抗菌药物的使用，从而减少住院时间、提高治愈率、改善预后。目前常用的微生物检测方法有痰涂片、痰培养、血培养、脑脊液、胸腹水化验、PCR等，随着二代测序(next-generationsequencing，NGS)技术的不断成熟和普及，为临床上感染性疾病的病原学诊断提供了一种新的有价值的诊断工具。现将NGS和PCR在临床上的部分应用进行综述。
国内分子诊断起步较晚，发展速度高于全球。在精准医疗、个性化用药等需求推动下，分子诊断技术在全球得到飞速发展，根据火石创造数据显示，-年全球分子诊断市场规模由57亿美元增长至.6亿美元，年复合增长率为12.18%，主要市场玩家包括罗氏、雅培、西门子、强生等。国内分子诊断虽然起步较晚，但在消费升级、*策扶持以及资本青睐等多重因素推动下，已经由产业导入期步入成长期。-年，我国分子诊断市场规模由25.4亿元增长至约.1亿元，年复合增长率达到31.63%，虽然仅占全球市场规模的16.86%，但是增速约为全球增速的2.6倍，主要企业包括达安基因、凯普生物、华大基因、贝瑞基因、艾德生物等。
分子诊断领域主要包括PCR（qPCR和dPCR）、二代测序技术（NGS）、荧光原位杂交（FISH）、基因芯片等，其中PCR是目前应用最成熟、市场份额最大的技术平台，在国内分子诊断中市占率为40%，在国内获批的分子诊断产品中，基于PCR技术的超过90%。与杂交技术和测序技术相比，PCR技术主要优势在于高灵敏度、易于推广，主要局限在于检测位点单一且已知，多重基因联合检测时可涵盖的基因数量受限，目前已经发展到第三代数字PCR（dPCR），短期内仍将是分子诊断主流技术平台；测序技术发展迅猛，虽然市占率较低但市场增速最快，其中二代测序技术NGS（高通量测序）是目前测序领域应用最广泛的技术，已经成为许多序列变异分析与科研应用的主要选择，但由于实验操作复杂、成本高等原因，在临床应用中仍处于起步阶段，应用前景广阔。
1.PCR：分子诊断主流技术平台，临床诊断“金标准”
PCR（聚合酶链式反应）是指利用DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）在体外条件下，催化一对引物间的特异DNA片段合成的基因体外扩增技术。PCR是生物体外的特殊DNA复制，最大的特点是能将微量的DNA大幅扩增。以实时荧光PCR技术为例，通过PCR技术进行分子诊断的主要流程包括：
1.核酸的提取和纯化：使用核酸提取试剂从病*、细菌等中提取出DNA；
2.核酸在引物约束下特异性的PCR扩增：在提取的DNA中加入扩增需要的反应液（酶、复制需要的原料、引物等），在PCR仪中完成扩增过程；
3.扩增产物的检测：通过荧光标记法检测DNA含量，从而判断病*DNA含量，给出诊断结果。
PCR技术最大的特点就是灵敏度高、特异性好、及时方便，在基础研究以及医学诊断、法医学和农业科学等各大领域应用广泛。在临床诊断中，PCR技术具有诸多优势：灵敏度高，靶细胞检出率可达1/万，病*检测灵敏度≥3RFU，最小细菌检出率为3个，检测样本纯度要低，仅需DNA粗提取；扩增反应在2-4小时内完成，使用简便、快捷。作为临床诊断的“金标准”技术，PCR广泛应用于血站核酸检测、疾控核酸检测、临床核酸检测等领域，其中，在传染病诊断和血筛检测中，PCR技术能缩短诊断的“窗口期”并且可以定量对病原体进行检测，相比于传统的免疫诊断方式，具有不可替代的优势，基于PCR医院对传染病诊断的“金标准”。PCR经过三代技术更迭，精确度和灵敏度不断提高。PCR技术最早由穆勒于年发明，经历了第一代定性PCR、第二代定量PCR和数字PCR三代技术迭代，其中第二代定量PCR包括荧光定量PCR（qPCR）以及在其基础上分化出来的ARMS（突变扩增阻滞系统）和HRM（高分辨溶解曲线）。三代技术的主要差异如下：
第一代定性PCR技术：采用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行分析，存在交叉污染、检测耗时长、只能做定性检测等缺点，目前处于衰退期，已基本被淘汰；
第二代荧光定量PCR（qPCR）技术：qPCR在一代定量PCR的基础上引入荧光探针标记法从而实现定量检测，目前发展最成熟、应用最广泛、临床普及率高，为现阶段主流应用平台，正处于从成长期向成熟期过渡的阶段，市场增速在20%以上；
第三代数字PCR（dPCR）技术：dPCR是在PCR原理的基础上利用芯片和荧光检测技术进行核酸绝对定量检测。芯片技术是dPCR的核心工艺，利用对样品进行分液处理进而实现“单分子模板PCR扩增”，达到定量检测的目的，具有更高的精确度和灵敏度，目前处于导入期，市场增速在10%-15%。
二代PCR：主流分子诊断平台，伴随诊断和感染性疾病领域为主
qPCR（荧光定量PCR）是目前应用最成熟、临床应用最广泛的技术平台。qPCR在国内外均为分子诊断临床应用最广泛的技术平台，尤其是在感染性疾病（病*性肝炎、性病和其他病菌/病*类等）和肿瘤伴随诊断领域，目前仍以qPCR技术平台为主。据不完全统计，截至年5月11日，国家药监局共批准了个PCR类产品，其中荧光定量PCR（qPCR）产品占比高达85.11%。在伴随诊断领域，NMPA获批的伴随诊断产品中有60%都是基于qPCR技术，而FDA批准的39个伴随诊断产品基于qPCR技术的产品占比也高达38.46%（15个）。
国内PCR行业竞争激烈，不同细分领域龙头效应显著。二代PCR技术门槛相对较低，国内获批的PCR检测产品数量多、竞争激烈，主要企业包括达安基因、艾德生物、凯普生物、之江生物、硕世生物、透景生物、圣湘生物等。从获批的PCR检测试剂盒数量维度看，达安基因拥有38种基于qPCR技术的检测试剂盒取得NMPA的批文；从不同细分应用领域维度看，各家产品线重合度较高，尤其是优生优育、性传播疾病、HPV检测等领域竞争激烈，但艾德生物、凯普生物、亚能生物凭借多年在不同细分领域的先发优势、技术积累以及渠道优势等分别在伴随诊断、HPV检测、地中海贫血检测领域处于绝对领先地位，其中凯普生物在HPV检测领域占据1/3市场份额，艾德生物在PCR伴随诊断领域具有绝对领先优势。
第三代数字PCR（dPCR）：应用前景广阔，未来发展趋势
和qPCR相比，dPCR优势包括：灵敏度高（可以达到单个核酸分子）、无需标准曲线或参照基因进行对比来测量核酸量、适合环境复杂样品的检测、能够有效区分浓度差异微小的样品。dPCR在国内尚处于起步阶段，目前仅有南京科维思生物的HER2基因扩增检测试剂盒（数字PCR法）获批，在肿瘤伴随诊断、肿瘤早筛、传染病检测、NIPT、药物基因组学等领域具有较大临床应用潜力和优势。根据沙利文数据显示，中国dPCR行业市场规模从年的14.6亿元增加至年的72亿元，CAGR=29.2%，到年市场规模预计将达到.6亿元。
国内*策利好+精准医疗需求双轮驱动数字PCR快速发展。数字PCR领域未来发展潜力巨大，主要驱动因素包括：
人口增长与老龄化：我国人口老龄化趋势导致肿瘤医药市场增长和体外检测需求增长，而数字PCR在肿瘤检测、传染病检测、遗传病等疾病检测上优势明显，医疗市场的扩容将进一步推动数字PCR的增长。
国内*策利好：根据国家科技部办公厅发布的《“十三五”医疗器械科技创新专项规划》，要求重点开发POCT检测、新型基因测序仪、随检全自动核酸检测系统、定量数字PCR等系统；
精准医疗与肿瘤治疗需求：精准医疗的基础在于个体化医疗，对致病突变检测和定量分析的精确性要求较高，亟需新一代PCR技术的应用，而数字PCR在这方面优势明显。
PCR技术更迭速度快，从传统的普通PCR到新兴的数字PCR，灵敏度不断提升。作为国内应用最为广泛的分子诊断技术平台，PCR具有灵敏度高、特异性好、使用方便等优点，广泛应用于感染性疾病病原体检测、肿瘤基因检测、血筛、遗传病检测等领域，占分子诊断市场规模的比例超过30%。第二代荧光定量PCR是目前PCR技术的主流，第三代数字PCR是未来发展方向，应用前景广阔。国内达安基因、艾德生物、凯普生物等是PCR技术领域的龙头企业，在传染病、HPV、伴随诊断等不同细分领域拥有绝对的竞争优势。
2.高通量测序（NGS）：引领分子诊断走向高端，应用前景广阔
测序技术更迭速度快，二代高通量测序（NGS）为市场商用主流。从年第一代DNA测序技术（Sanger法）发展至今，测序技术经历了第二代高通量测序（NGS）、第三代单分子测序技术和第四代纳米孔测序技术的发展变革，各代技术应用领域不尽相同，各有优缺点，目前处于三代技术并存的局面。第一代Sanger测序技术具有测序读长较长、准确率高的优点，但由于通量低、成本高等因素没有得到大规模应用；二代测序技术自年以来快速发展，凭借高通量、低成本、测序时间端等优势，在全球测序市场中仍占据主导地位；第三/四代技术在测序流程、测序时间和读长上进一步优化，在ctDNA测序、单细胞测序等也具有明显优势，是未来发展趋势，未来随着技术的改善有望进入成熟应用阶段。
高通量测序技术（NGS）又称为下一代测序技术，是指通过模板DNA分子的化学修饰，将其锚定在纳米孔或微载体芯片上，利用碱基互补配对原理，在DNA聚合酶链反应或DNA连接酶反应过程中，通过采集荧光标记信号或化学反应信号，实现碱基序列的解读，一次性可完成几十万至上百万条序列的测定。NGS技术可提供满足评估目标靶向基因所需的扩展性、速度和分辨率。可以同时对许多样本中的多个基因进行评估，如此便可运行多个独立的分析，从而节省时间并降低成本。另外，与范围更广的方法（如全基因组测序）相比，靶向基因测序生成的数据量更少，更易管理，因而分析起来更加轻松。
多因素驱动NGS市场高速发展。随着NGS技术进步和测序成本的降低、肿瘤医生和病人对NGS检测认知不断完善、测序服务对象和应用细分领域的拓展、企业间合作的增加，NGS有望迎来快速发展。根据美国MarketsandMarkets报告显示，预计全球高通量基因测序市场规模将从年的78亿美元增加至年的亿美元，CAGR为20.9%。
感染性疾病病原体检测：在病原微生物检测方面，NGS检测具有独特的优势，不受限于传统PCR技术需要利用已知物种的DNA序列设计PCR引物探针，可实现对未知的疾病相关的微生物快速鉴定，目前已经成功应用于H1N1病*基因组的发现和结核杆菌分子分型等。但目前NGS在微生物领域应用仍处于方法学的标准品验证阶段，全球尚无该领域的检测试剂盒获批，应用前景值得期待。
1 NGS在中枢神经系统感染中的应用单核细胞增生李斯特菌是一种革兰阳性、兼性细胞内细菌，可以污染食物，摄入后可导致多种动物感染，包括牲畜和人类。单核细胞增生李斯特菌感染的严重程度取决于细菌菌株的*力和宿主的免疫状态[7]。由单核细胞增生李斯特菌引起的脑炎虽很罕见，但有时是致命的。使用常规脑脊液测试很难早期诊断，而NGS越来越多地用于检测病原体。Yao等[8]收集了年1月至年10月医院的3例临床疑似李斯特菌脑膜脑炎的患者，征得同意后将3例患者纳入研究。在给予抗生素治疗之前，按照标准程序收集脑脊液，快速冷冻并在－20℃下储存。此3例急性/亚急性脑膜脑炎患者磁共振成像和血培养提示疑似单核细胞增生李斯特菌的诊断，而脑脊液培养是阴性的。在以上3种情况下，对收集的脑脊液进行NGS鉴定并测序，显示符合单核细胞增生李斯特菌的读数，并且获得了后期PCR检测结果的验证。首次报道了NGS在中枢神经系统李斯特菌感染中的应用。李斯特菌脑炎通常呈现双相病程。前驱症状包括发烧、头痛、恶心、呕吐，然后发展为进行性神经系统症状，甚至发展到呼吸衰竭[9]。此报道中有2例患者发生呼吸衰竭。因此，早期明确诊断和适当的早期抗生素治疗对预后至关重要。
王小娟等[10]为明确5例中枢神经系统感染患者的致病微生物，采用血液与脑脊液常规、生化、细胞学、培养、革兰染色等检测方法，应用BGISEQ-测序平台进行脑脊液病原体测序。利用Premier设计了2对引物进行PCR验证，扩增后采用ABIPrismaXL型基因分析仪对其进行测序分析。脑脊液NGS共检测到李斯特菌的核酸序列数57～条，平均.8条。样本检出李斯特菌序列数与检出微生物核酸总序列比值为15.08%～90.84%，平均60.21%，检测深度为1，基因覆盖度为0.23%～14.00%，平均3.80%。NGS在李斯特菌检测方面具有优势，在较低基因组覆盖下也可有效识别出细菌病原体[11]。病*性脑炎是遗传性原发性免疫缺陷患者发病和死亡的主要原因，如X连锁性丙种球蛋白血症[12]。Fremond等[13]报道了星状病*感染的脑膜炎病例。患有X连锁性丙种球蛋白血症的14岁男孩，维持每3周高效价丙种球蛋白注射治疗，表现为进行性认知功能障碍、复发性癫痫发作，脑脊液、血液、痰和粪便等未发现病*。脑脊液分析白细胞计数、葡萄糖水平和蛋白质水平是正常的，PCR和RT-PCR是阴性的，右侧额叶脑组织活检、组织学结果无特异性。采用NGS进行深度测序并进行分析，鉴定了星状病*基因组大片段，显示出与VA1/HMO-C进化枝高水平同源性，获得了完整的基因组，并将该新菌株命名为HAstV-VA1/HMO-C-PA。更改治疗方案联合静脉注射利巴韦林治疗，患者运动行为、认知得到改善。NGS其中一个主要优点就是不仅限于细菌病原体，还可以检测鉴定真菌和病*[14,15]。NGS在疾病诊断中的可用性越来越高。
2 NGS在肺部感染中病原体检测作用肺部感染病发率较高，是临床很常见的呼吸系统感染性疾病，治疗不及时会发展为重症肺炎、呼吸衰竭等，预后很差，病死率高，严重威胁人类健康。He等[16]报告了3例侵袭性肺曲霉菌病(invasivepulmonaryaspergillosis，IPA)，其传染性强，病死率高。但IPA的临床诊断却很困难，很难获得微生物学证据。患者行常规的抗感染治疗症状未见好转。对以上3例患者进行支气管肺泡灌洗，使用NGS对支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid，BALF)进行测试。在收到样品后48h内，NGS即检测到3例患者BALF中烟曲霉的序列读数。其中2例患者BALF中的曲霉半乳甘露聚糖检测为阳性，1例患者使用传统方法检测为阴性，包括血清半乳甘露聚糖检测和BALF半乳甘露聚糖检测均为阴性，痰培养未发现真菌。即使接受治疗，患者仍有反复发热、咳痰、胸闷等症状，最后BALF通过NGS检测到烟曲霉，证实为IPA。3例患者均给予伏立康唑抗真菌治疗，上述症状逐渐好转，复查胸部CT病灶明显吸收。IPA是一种致命的机会性真菌感染，常发生于血液系统恶性肿瘤患者。然而在非传统宿主中也报道了许多IPA病例，尤其是COPD患者[17]。在这些非中性粒细胞减少患者中，更容易发生误诊事件[18]。因此，早期明确肺曲霉菌病诊断具有重要意义。Parize等[19]报道了一项多中心前瞻性研究，采用NGS技术对例免疫缺陷患者进行病原体检测，同时送检血清、咽拭子、穿刺液体等标本。该前瞻性研究结果表明NGS较传统检测方法有较高的检出率以及更高的阴性预测值(64/65，95%CI：0.95～1)。NGS可检测出更多临床相关的病*和细菌。因此，NGS是免疫功能受损或免疫缺陷患者病原体诊断的前景方法。Pendleton等[20]使用宏基因组学检测呼吸道病原体，报道了患有结缔组织病相关间质性肺炎的41岁女性患者和59岁败血症男性患者，使用宏基因组测序分别快速检测出铜绿假单胞菌菌株和金*色葡萄球菌菌株。NGS在加速和改善临床常见致命疾病的诊断和治疗方面具有很大潜力。
结核分枝杆菌在肺部感染的病原体中也占据了重要部分。Nomura等[21]进行了一项回顾性研究，在心脏手术期间暴露于受污染的加热器-冷却器装置的患者容易感染分枝杆菌嵌合体(M.chimaera)。抗酸杆菌培养的诊断金标准通常需要侵入性取样。研究人员采用NGS方法对10例曾做过心脏手术的患者的血浆进行检测，同时对获取的标本进行抗酸杆菌培养。血浆NGS检测到10例患者中有9例患有侵袭性疾病，其检测所需的中位时间为4d。其中7例患者血浆NGS是第一个提供M.chimaera感染病原学确认的试验。相反，抗酸杆菌培养物转为阳性所需的中位时间为20d，确认M.chimaera的中位时间为41d。该队列中获得的24个抗酸杆菌血培养物中，仅4个(17%)为阳性。其中90%的患者进行了侵入性手术，并且仅在5例患者(50%)的标本培养中提示了分枝杆菌生长。M.chimaera感染的患者因潜伏期较长以及其非特异性症状而不易被识别[22]。因此血浆NGS可以比抗酸杆菌培养物更快更准确地检测M.chimaera，使其成为一种很有价值的新型诊断工具。另一方面，结核分枝杆菌耐药也是全世界主要的健康问题之一。Ko等[23]应用NGS对易感结核分枝杆菌菌株和耐药菌株进行遗传分析，并通过估算NGS的阳性预测值和阴性预测值来检测菌株的耐药性。研究人员在Hallym大学医学中心收集了36株从临床标本中分离的结核菌株，通过培养基制作、核酸提取、PCR和基因测序、生物学信息分析、估计预测值及统计分析综合程序得出结果，共有24种变体与耐药性相关，基因型和表型都一致对异烟肼、利福平、乙胺丁醇敏感，对链霉素、阿米卡星反应较差，所有药物类别阴性预测值均大于97%，而阳性预测值为44%～%。该研究成功地应用NGS进行了结核分枝杆菌耐药性、敏感菌株的遗传分析，获得了多态性和可能多态性列表，有可能成为在分枝杆菌试验中应用NGS的测试指导。
肺部感染的病原体很多，其中病*感染也占据了重要的位置，而且病*结构非常简单，且更易突变，临床上不易检测到。Yang等[24]使用大量寡核苷酸探针来富集34种呼吸DNA和RNA病*的序列，减少NGS数据中的非病*读数并实现了基于NGS测序病原体鉴定的高性能。NGS在靶向检测呼吸道病*方面使用lluminaMiSeq系统扩增和测序富集文库，实现了与分子测定相当的病*检测灵敏度，并获得了每种病*的部分甚至完整的基因组序列以获得精准的基因分型和变体分型。Wollants等[25]报道了1例中老年男性感染西尼罗河病*，它是一种广泛存在的全球再生病原体，感染初始可能仅有流感样症状，随着病情发展可导致多脏器功能衰竭等危重情况。入院血象、尿沉渣、胸片、超声等均正常，对BALF进行多重PCR检测，结果显示22种不同的呼吸道病原体呈阴性。结核分枝杆菌的单重PCR结果也为阴性。免疫荧光和PCR检测卡式肺囊虫的结果仍是阴性。脑脊液分子诊断结果显示13种病原体呈阴性，血清学检测显示12种病原体呈阴性。采取NGS对BALF样本和病*培养物进行检测，对NGS结果分析，确定了完整的西尼罗河病*基因组(nt)。并且在BALF标本和细胞培养物上进行新的RNA提取和新开发引物逆转录PCR，并进行Sanger测序，该阳性标本序列与来自NGS获得的完整基因组的序列相同。分子检测是用于诊断呼吸道病*性病原体的金标准方法，NGS较RT-PCR相比可提供更多的病*序列和分型信息。所以，在传统方法检测病原体阴性时，NGS可成为识别临床标本中未知病原体的有力工具。
3 NGS在脓*血症中进行病原体检测脓*症是由血流感染所引起的临床综合征，并且脓*性休克是患者对治疗措施反映出治疗不佳的一种临床表现[26]。脓*血症患者病死率在全球范围内很高，尤其是在不能及时明确病原体和抗生素非合理使用的情况下病死率会进一步增加[27]。Abril等[28]报道了1例牧羊犬咬伤的60岁男性患者，1周后出现体温升高、心率加快、血压下降，经验使用广谱抗生素治疗。入院血培养阴性，脑脊液革兰染色和单纯疱疹病*PCR均为阴性。收集患者血浆标本进行NGS，24h内NGS分析检测到高水平微生物DNA，其读数沿整个犬咬二氧化碳嗜纤维菌(Ccanimorsus)基因组排列，检测出Ccanimorsus，之后并对血培养物分离进行16SrRNA测序确认。该病例首次报告了其在脓*症重症患者中的应用，突出了NGS在临床有限时间范围内提供相关诊断性数据的巨大希望，并对改善抗生素治疗具有重要意义。
Grumaz等[29]报道了1篇关于NGS技术应用于脓*症患者病原体检测的观察性研究，纳入了25例患者，其中包括7例脓*症患者、12名健康志愿者、6例接受过腹部手术的患者(在该研究中分析了不同时间点的血浆)，总计62份血浆样本，同时进行厌氧血培养、需氧血培养、PCR检测、伤口拭子、导管和粪便标本培养，以及NGS对血浆标本进行检测。脓*性休克患者的cfDNA浓度水平增加(平均.23μg/L)，尤其在脓*症发病期间(平均.30μg/L)；并且与对照组相比发病期间脓*症患者的平均分类读数较高(9.82%)，明显高于健康组(3.50%)和腹部手术前组(2.64%)，这表明脓*症患者细菌负荷较高。而且在血浆样本中发现了来自致病细菌显著水平的DNA片段，检测出病原体有阴沟肠杆菌、金*色葡萄球菌、单纯疱疹病*、肺炎克雷伯菌、脆弱拟杆菌，并在28d试验期内完善通过传统方法检测到的病原体数据，其与NGS检测结果匹配，从而得到证实。所以，该方法有望成为脓*血症患者比较有前景的诊断方式。
结语与展望现今感染性疾病发病率越来越高，随之而来的疑难病原体感染发生率也逐渐增加，从而加大了临床医师诊治的难度。若诊断不明确、治疗不及时，病情会迅速进展，乃至发生重症炎症、多脏器功能衰竭等危重疾病，甚至死亡。NGS技术不断发展，改变了基因组分析，为临床微生物实验室的应用开辟了很多新机会，其快速无偏的特性补充了传统方法检测病原体的不足，有很好的临床使用价值。但NGS目前仍缺乏相关公认的标准，又因价格较昂贵，临床上仍以传统方法检测为主，目前NGS总体使用率仍不高。但随着社会的快速发展，有理由相信NGS在未来临床感染性疾病中的使用会更加广泛，利用其快速精准明确病原体的优势，成为临床上一项重要的医学检验技术。
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