口服精氨酸抑制血小板钙波动机制研究
口服精氨酸抑制血小板钙波动机制研究
口服精氨酸抑制血小板钙波动机制研究
中华医学检验杂志 2000年第1期第23卷 论著
作者：丛玉隆 金朝 李向飞 李楠 陆庆国
单位：丛玉隆（100853 北京，解放*总医院临检科）；金朝（100853 北京，解放*总医院临检科）；李楠（100853 北京，解放*总医院临检科）；陆庆国（100853 北京，解放*总医院临检科）；李向飞（空*第四六六医院）
关键词： 血小板；精氨酸；钙
【摘要】目的 观察口服精氨酸对正常人血小板钙波动的影响并探讨其作用机制。方法 选择10名至少2周内未服用任何药物，血小板聚集功能正常的健康男性志愿者10例。年龄(26.7±3.6)岁，体重(67.9±5.0) kg。志愿者口服L-精氨酸4 d，每日20 g，分3次服用。用激光扫描共聚焦显微镜观察口服精氨酸前后单个血小板钙波动变化。结果 服用精氨酸后，血清精氨酸浓度［(80.90±30.17) μmol/L和(200.19±42.99) μmol/L,P＜0.01］，血小板胞浆内环磷酸鸟苷浓度［(1.91±0.20) pmol/109血小板和(2.14±0.34) pmol/109血小板，P＜0.05］比服用前升高；二磷酸腺苷诱导的血小板钙波动峰值降低。结论 口服精氨酸可以通过激活血小板的左旋精氨酸/一氧化氮通路，促进一氧化氮和环磷酸鸟苷的合成使二磷酸腺苷诱导的血小板钙波动峰值降低。
Oral L-arginine in reducing the peak value of platelet intracellular calcium oscillations induced by ADP
CONG Yulong
（Department of Medical Laboratory,）
JIN Zhao, LI Xiangfei,et al.
（Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China）
【Abstract】Objective To observe the effect of oral L-arginine upon the peak value of platelet intracellular calcium oscillations induced by thods Ten male volunteers were selected ［mean age: (26.7±3.6) years; weight: (67.9±5.0) kg］. No drugs were taken during 2 weeks before study. Oral arginine was given for 4 days (20 g three times a day). Platelet intracellular calcium oscillations were observed by laser scanning confocal microscope before and after taking sults The plasma levels of arginine ［mean±s, (200.19±42.99) vs (80.90±30.17) μmol/L, P＜0.01］ and platelet intracellular cGMP ［(2.14±0.34) vs (1.91±0.20) pmol/109 platelets, P＜0.05］ were higher after taking arginine than before. The peak value of platelet intracellular calcium oscillations was nclusions Oral L-arginine could inhibit platelet intracellular calcium oscillations induced by ADP through promoting NO and cGMP synthesis.
【Key words】Blood platelets;Calcium;Arginine
钙离子作为第二信使在血小板的活化过程中起到了重要的作用［1］。血小板在诱导剂的作用下细胞内钙离子浓度(［Ca2+］i)升高并产生钙波动，同时激活了精氨酸/一氧化氮通路［2］，我们对这两者之间的相互关系做了初步的探讨。
材料和方法
1.研究对象：选择至少2周内未服用任何药物，血小板聚集功能正常的健康男性志愿者10例。年龄(26.7±3.6)岁，体重(67.9±5.0)公斤。受试者服药前抽血检测，然后口服精氨酸4 d，每日20 g，分3次服用，第4 d服用1次，3 h后抽血测试。
2.试剂：L-精氨酸碱(日本味之素公司)；二磷酸腺苷(美国Biopool公司)；Fluo 3-AM(美国分子探针公司)；无钙HEPES缓冲液(145 mmol/L NaCl；5 mmol/L KCl；1 mmol/L MgSO4；5 mmol/L葡萄糖；10 mmol/L Hepes；pH调至7.40)，125I-环磷酸鸟苷(cGMP)试剂盒(上海中医学院)，多聚赖氨酸(美国Sigma公司)。
3.仪器：Insight plus激光扫描共聚焦显微镜。
4.方法：(1)血清精氨酸浓度测定：抽取静脉血1 ml，3 500 r/min离心15 min分离出血清，按1∶1的比例将血清和磺基水杨酸混和振荡，14 000 r/min离心15 min，取上清液采用高分辨标准分析法测定血清精氨酸浓度。(2)cGMP浓度检测：将富含血小板血浆作血小板计数后，在37℃下加入终浓度为20 μmol/L的二磷酸腺苷诱导血小板聚集后3 000 r/min离心15 min，弃去上清，沉淀以pH 4.75的醋酸缓冲液悬浮，振荡，放入-20℃冰箱冻融3次，离心取上清液用125I-cGMP试剂盒测定血小板cGMP浓度。(3)激光扫描共聚焦显微镜观察血小板钙波动：在培养皿底部钻一直径约1.5 cm的孔，粘上一张超薄载玻片，形成一小室，玻片包被0.4 g/L的Poly-lysine。取200 μl无钙HEPES缓冲液和2 μl血小板悬液加入小室，静置10 min后冲洗小室3次，最后加入含1 mmol/L Ca2+的HEPES缓冲液200 μl，在37℃水浴箱内预热3 min后，在激光扫描共聚焦显微镜下观察并记录加入二磷酸腺苷前后单个血小板的钙波动变化。
结果
1.血清精氨酸浓度：在服用精氨酸前血清精氨酸浓度为(80.90±30.15) μmol/L，服用精氨酸后升高至(200.19±42.99) μmol/L，P＜0.01。
2.血小板cGMP浓度：服L-精氨酸前血小板cGMP浓度为(1.91±0.20) pmol/109血小板，服L-精氨酸后升高至(2.14±0.34) pmol/109血小板，P＜0.05。
3.血小板钙波动变化：数据的处理按照规一化法做曲线，以开始时刻的荧光强度为一个单位量，图中纵座标代表加入二磷酸腺苷后血小板每一时刻胞内钙离子荧光强度(即钙离子浓度)与开始时刻荧光强度的比值，横座标代表钙离子荧光强度变化的时间过程。图中可见未加入诱导剂时血小板的荧光强度也表现出轻微的波动(图1)，这可能是因为(1)在标本的制备过程中血小板有些轻微的激活。(2)仪器的基线不够稳定。加入二磷酸腺苷后，细胞内［Ca2+］i以波动的形式升高，达到峰值的荧光强度是静息状态的2.5倍以上(图2)。服精氨酸后，血小板在二磷酸腺苷诱导下产生钙波动的振幅降低，［Ca2+］i达到峰值的荧光强度与静息状态的比值小于2.0(图3)。
图1 静息状态血小板［Ca2+］i随时间变化的曲线
图2 加入二磷酸腺苷后观察到的血小板钙波动现象
图3 口服精氨酸后二磷酸腺苷诱导的血小板钙波动峰值降低
讨论
越来越多的研究表明非兴奋性细胞能够和兴奋性细胞一样表现出具有节律性的生物行为，这些行为是由细胞内的钙波动引起的。细胞外的钙离子进入细胞内或细胞内钙库释放钙离子都可以引发钙波动，表现为胞浆内钙离子浓度周期性地升高和降低。
钙波动的形式多样，不同的细胞有不同的形式，同一种细胞在不同的诱导剂作用下也可以产生不同样式的波动。钙波动的机制也未完全明了，具有代表性的有以下几种学说［3，4］：(1)三磷酸肌苷(IP3)-单钙贮存池学说：细胞内的某个或某些细胞器(如内质、肌浆、血小板的致密管道系统)含有丰富的钙离子，在受到刺激后通过释放大量钙离子进入胞浆或摄取胞浆钙离子等方式参与钙离子的调控，这就是钙贮存池。本学说认为细胞内只有一个钙贮存池-IP3敏感池参与钙波动形成。受体激活磷脂酶C，生成IP3，IP2与IP3敏感池的受体结合，使钙池上的钙通道开放，释放大量钙离子进入胞浆，［Ca2+］i升高，进一步激活磷脂酶C形成正反馈，同时IP3又被磷酸酶分解成IP2。钙泵将胞浆内的钙离子泵回钙贮存池使［Ca2+］i下降。当钙池内钙离子浓度到达一定程度时，又一次在IP3的作用下释放钙离子，开始下一循环。(2)双钙贮存池学说：该学说认为IP3并不是引起细胞内钙释放的唯一机制，在细胞内同时存在着IP3敏感池、IP3不敏感池和钙离子诱发的钙释放机制。IP3激发IP3敏感池释放钙离子，钙离子被IP3不敏感池摄取，当该池充满后就以钙离子诱发的钙释放方式释放钙离子至胞浆，这两个步骤不断循环产生钙波动。(3)钙调蛋白-单钙贮存池学说：激动剂与受体结合后，在G蛋白的介导下激活磷脂酶C，生成IP3，IP3与钙贮存池上的受体结合促使其钙通道开放，释放大量钙离子入胞浆，形成钙尖峰。同时［Ca2+］i升高促使钙通道上的钙-钙调蛋白复合物形成，抑制其开放，钙离子释放减少。钙贮存池膜与细胞膜的钙泵分别将胞内的钙离子泵回贮存池或泵出细胞，对钙通道的抑制以及这两个钙泵的共同作用使［Ca2+］i下降，［Ca2+］i降低到一定程度时，钙-钙调蛋白复合物减少，钙贮存池膜钙通道的抑制被解除，通道重新开放，钙波动进入下一周期。此学说也不需要假设存在IP3波动。
本实验表明正常人服用精氨酸后，血中精氨酸浓度及血小板胞浆内cGMP浓度明显升高，二磷酸腺苷诱导的血小板钙波动的峰值降低。
二磷酸腺苷可以通过打开血小板细胞膜上的钙离子通道引发胞外钙离子内流，同时也可以激活磷脂酶C，产生IP3，促使胞内的致密管系统释放钙离子，导致［Ca2+］i升高［5］。血小板本身具有L-精氨酸/一氧化氮通路，血小板可以通过摄取外界的L-精氨酸来合成一氧化氮［2，6］。服用精氨酸后，血液中精氨酸浓度升高，促使血小板摄取精氨酸并产生大量一氧化氮，一氧化氮是可溶性鸟苷酸环化酶最强的激活剂，它可以和可溶性鸟苷酸环化酶活性基团上的二价铁离子结合，激活该酶，促进三磷酸鸟苷环化，产生cGMP。cGMP可能从以下三个方面抑制了血小板［Ca2+］i升高，降低了钙波动的峰值［7，8］：(1)激活蛋白激酶C，蛋白激酶C可以抑制磷脂酶C的活性，IP3生成减少，胞内IP3敏感池释放钙离子减少。(2)激活cGMP依赖的蛋白激酶Ⅰ，蛋白激酶Ⅰ可能通过激活细胞膜上的Ca2+-一氧化氮酶，使胞内的钙离子泵出到胞外。(3)作用于血小板膜表面受体依赖的钙通道，抑制二磷酸腺苷诱导的胞外钙离子内流。
参考文献
1 Rink TJ, Smith SW, Tsien RY, et al. Cytoplasmic free Ca2+ in human platelets: Ca2+ thresholds and Ca-independent activation for shape -change andsecretion. FEBS Lett, 1982, 148：.
2 Radomski MW, Palmer RMJ, Moncada S. An L-arginine/nitric oxide pathway present in human platelets regulates aggregation. Proc Natl Acad Sci USA, 1990,87：.
3 Berridge MJ. Calcium Oscillations. J Biol Chem, 1990,265：.
4 Berridge MJ, Galione A. Cytosolic calcium oscillators. FASEB J, 1988, 2：.
5 Vickers JD, Rathbone RLK, Mustard JF. Changes in phosphatidylinostiol-4, 5-bisphosphate 10 seconds after stimulation of washed rabbit platelets with ADP. Blood, 1982, 60：1247.
6 Vasta V, Meacci E, Farnararo M. ldentification of specific transport system for L-arginine in human platelets. Biochem Biophy Res Commun, 1995,206：.
7 Vandrager AB. Signalling by cGMP dependent protein kinases. Mol Cell Biochem, 1996,157：.
8 Habrugge M, Friedrich C, Eigenthaler M, et al. Stoiometric and reversible phophorylation of a 46 kd protein in human platelets in response to cGMP and cAMP elevating vasodilators. J Biol Chem, 1990, 265： .
收稿日期：